AN-708蛋白聚集

概述

基于治療的蛋白質(zhì)溶液聚集可能產(chǎn)生有害的免疫原性。對(duì)于較大尺寸的團(tuán)聚體，可以測(cè)量這些團(tuán)聚體，但在0.15至2微米范圍內(nèi)的較小團(tuán)聚體很難量化。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)可以證明聚集體的存在，但不能提供任何關(guān)于聚集體的濃度的信息。單粒光寫傳感器技術(shù)(SPOS)現(xiàn)在可以測(cè)量聚集蛋白的大小和濃度，并成為這一應(yīng)用的技術(shù)。

引言

生物治療藥物已被證明容易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗藥物抗體(ADA)。證據(jù)表明，蛋白質(zhì)聚集具有增強(qiáng)免疫原性的能力，因此增強(qiáng)了對(duì)蛋白質(zhì)單體形式的免疫反應(yīng)生物治療蛋白的通常通過(guò)一系列步驟準(zhǔn)備注射用藥物，例如:

1.蛋白質(zhì)合成與純化

2.在運(yùn)輸過(guò)程中為了穩(wěn)定而進(jìn)行凍干

3.注射前的復(fù)溶

雖然凍干的好處是可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)以供運(yùn)輸，但目前還不清楚凍干蛋白質(zhì)在復(fù)溶后是否會(huì)恢復(fù)到其單體狀態(tài)。如果少量的蛋白質(zhì)在這一過(guò)程中聚集，就有可能引起患者對(duì)治療過(guò)程的免疫反應(yīng)。

開發(fā)一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)定復(fù)溶后大小與濃度的直方圖形式的聚集程度，將能夠在配制過(guò)程中篩選這些藥物，以確保在復(fù)溶后中導(dǎo)致單體釋放而不會(huì)產(chǎn)生的聚合。

粒子計(jì)數(shù)技術(shù)

很少有技術(shù)能夠測(cè)量目標(biāo)尺寸范圍內(nèi)的顆粒大小和濃度以量化蛋白質(zhì)聚集。許多藥學(xué)科學(xué)家都熟悉的光阻法，因?yàn)樗挥糜诿绹?guó)USP788-注射液中的不溶性微粒和USP729測(cè)量脂質(zhì)乳狀液尾部的試驗(yàn)。但是傳統(tǒng)光阻法的傳感器檢測(cè)下限是1μm附近，并且濃度限制對(duì)于許多蛋白質(zhì)聚集樣品來(lái)說(shuō)太低。

PSS Accusizer FX-Nano系統(tǒng)(如下所示)是設(shè)計(jì)在更小的顆粒尺寸和更高的濃度下工作。這是通過(guò)使用兩個(gè)傳感器完成的;FX-Nano傳感器測(cè)量范圍為0.15-0.6μm, LE400傳感器測(cè)量范圍為0.5-400μm。新的FX-Nano傳感器使用聚焦光束來(lái)減少檢測(cè)的總體積，從而提高了傳感器的濃度限制。該傳感器與SIS進(jìn)樣器聯(lián)用，使進(jìn)樣體積低至250μL。此配置通過(guò)了USP787治療性蛋白注射劑中的不溶性微粒。

通過(guò)兩個(gè)傳感器一次就能測(cè)試聚合蛋白的大小和濃度，它的動(dòng)態(tài)范圍是0.15 -40µm 。LE傳感器單獨(dú)使用時(shí)的工作范圍為0.5 -400 µm，這使它成為非常靈活的系統(tǒng)。

案例1：過(guò)濾前后的免疫球蛋白

免疫球蛋白(IgG)，約150 kDa, 1% PBS。使用FX和LE傳感器以及SIS采樣器的Accusizer FX- nano來(lái)測(cè)量未稀釋的樣品。結(jié)果如圖1所示。總顆粒計(jì)數(shù)= 109,343，濃度= 9.7 x 10⁸顆/mL。

圖1:未過(guò)濾的IgG

使用PSS的Nicomp 380動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)試它，通過(guò)圖2，以評(píng)估單體的大小并大致了解聚集蛋白的大小。峰＃1（天然蛋白）：14.6nm，強(qiáng)度52％（總質(zhì)量99.6％）。2號(hào)峰（聚集的尾巴）：395nm，強(qiáng)度為48％（總質(zhì)量的0.4％）。 AccuSizer FX-Nano被用于詳細(xì)研究聚集體在200-500 nm或更大尾端。

圖2: DLS Nicomp380測(cè)試未過(guò)濾IgG的數(shù)據(jù)

蛋白質(zhì)樣品然后通過(guò)0.2µm再次過(guò)濾后，使用AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)分析。過(guò)濾前后的對(duì)比結(jié)果如圖3所示。PBS的結(jié)果也顯示為黑色。過(guò)濾后的濃度從9.7×10⁸顆/mL降低到3.1×10⁸顆/mL。AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)可以清楚地看到聚集顆粒尾巴的減少，并且可以輕松識(shí)別。

圖3:過(guò)濾前(藍(lán)色)和過(guò)濾后(紅色)。

案例2：孵放前后的免疫球蛋白

樣品制備用于研究孵育對(duì)IgG蛋白樣品的影響。圖4顯示了在37°C孵育之前，然后在孵育1和6小時(shí)后IgG樣品的粒徑分布。僅使用AccuSizer FX系統(tǒng)測(cè)量樣品。將聚集蛋白定義為> 0.7μm，濃度降低如下：9.77、7.75，降至5.08 x 10⁵顆/ mL。顯然，這種聚集程度隨熱培養(yǎng)的增加而降低，表明溶出度提高。聚集體的尾部在圖5中進(jìn)行了放大，以獲得更多詳細(xì)信息。

圖4:時(shí)間0(藍(lán)色)，1小時(shí)(紅色)，6小時(shí)(黑色)

圖5:聚集蛋白尾部的放大

案例2：蛋白質(zhì)在不同的儲(chǔ)存和加工條件

客戶提供了未知的蛋白質(zhì)。在AccuSizer FX-Nano上分析了緩沖液和三種不同的制備/存儲(chǔ)條件，以確定顆粒大小和聚集蛋白的濃度。表1中顯示了緩沖液和蛋白質(zhì)樣品中> 0.19 µm的顆粒濃度。圖6中的差異計(jì)數(shù)格式和圖7中的累積格式顯示了圖形結(jié)果。

表1:緩沖液和三個(gè)蛋白樣品的顆粒濃度

圖6:差異分布

圖7:累積分布

圖8和圖9顯示了相同的聚合蛋白數(shù)據(jù)，但Y軸上的濃度以對(duì)數(shù)標(biāo)度表示，以便更好地顯示結(jié)果的大濃度范圍。

圖8:微分分布，對(duì)數(shù)尺度

圖9:積分分布，對(duì)數(shù)尺度

結(jié)論

AccuSizer FX-Nano提供了一種分析工具，能夠輕松量化蛋白質(zhì)聚集體的大小和濃度。*的兩個(gè)傳感器方法涵蓋了動(dòng)態(tài)范圍的廣泛動(dòng)態(tài)范圍，可提供聚集蛋白尾巴的詳細(xì)高分辨率視圖。的計(jì)數(shù)/ mL數(shù)據(jù)可用于比較不同濃度樣品的結(jié)果。SIS采樣器可以處理此應(yīng)用程序所需的小樣本量。另外，通過(guò)移除FX-Nano傳感器，該系統(tǒng)可用于標(biāo)準(zhǔn)的USP <787>和<788>注射用顆粒物。